El dibujante empezó su carrera profesional en los años 30, trabajando como dibujante en prensa y estudios de animación. Trabajó como ayudante de animación para los dibujos de «Popeye, el marino» en el estudio de Max Fleischer, responsables de «Betty Boop» y «Superman».

Más tarde conoció a Joe Simon cuando ambos trabajaron en Fox Comics, y le siguió hasta Timely hoy conocido como Marvel Comics. Con el boom superhéroico creado con la aparición de Superman en 1938, Kirby empezó a trabajar en un género cada vez más orientado a la lucha contra el nazismo, creando junto a Joe Simon al Capitán América en 1940.

El primer número de «Los 4 Fantásticos» apareció en noviembre de 1961, y la humanidad de los personajes, sumada a la combinación de elementos de otros géneros mucho más comerciales de la época, catapultó a la serie en las listas de ventas. Tras el éxito de Los 4 Fantásticos, Lee y Kirby empezaron a colaborar juntos en la creación de más y más series para Marvel, hasta que en 1970 Kirby deja la editorial para trabajar con sus propios guiones en DC Comics.

También fue el responsable de una psicodélica adaptación al comic del film de Stanley Kubrick 2001: Odisea del Espacio.